细胞与分子免疫学杂志

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甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)遏制HEK293细胞甲基化修饰的IL-6启动子活性及其分子机制

作者:

胡柯1, 李玉娴1, 曹湘玉1, 陈月富1, 陈立军1, 金玲1, 谭碧峰2, 尹辉明3, 黄民江1*(湖南医药学院: 1医学院, 2第一附属医院心血管病科, 3第一附属医院呼吸与危重症病科, 湖南 怀化 418000)

出版年,卷期:

2022 第(38)卷 第(3)期 起止页码 204-211 页

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摘要:

目的 在HEK293细胞甲基化修饰白细胞介素6(IL-6)启动子序列并过表达甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)以及转录因子P300, 探讨MeCP2抑制IL-6转录活性的分子机制。方法 通过电泳迁移率实验(EMSA)对P300 IL-6启动子区域的P300结合位点进行验证, IL-6启动子序列连接于荧光素酶报告质粒并转染HEK293细胞, 同时利用规律间隔的成簇短回文重复序列-去活性Cas9核酸酶-DNA甲基转移酶3A(CRISPR-dCas9-DNMT3A)转染介导启动子的甲基化修饰, 再转染MeCP2以及P300过表达质粒。亚硫酸氢盐测序PCR分析各组IL-6启动子区域胞嘧啶甲基化修饰情况;  Western blot法检测胞内MeCP2、 P300蛋白水平;  通过化学发光检测仪测定HEK293荧光素酶活性, 并结合染色质免疫沉淀测序技术(ChIPseq)分析各组P300以及MeCP2在IL-6启动子区域的结合水平。结果 EMSA证实小鼠IL-6启动子部位存在P300结合位点;  CRISPR-dCas9-DNMT3A转染HEK293细胞能够成功甲基化小鼠IL-6启动子;  MeCP2以及P300过表达质粒能够稳定合成目标蛋白, 且不受其他转染影响。相比于未被修饰的启动子, 甲基化修饰可降低启动子转录活性, 且于P300过表达情况下, 较之单纯甲基化修饰, 过表达MeCP2还将进一步遏制启动子转录活性。此外, 甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后, 过表达P300未提升启动子转录活性;  而在其他转染条件下, 过表达P300均能促进转录活性。Chip-seq分析进一步表明, 启动子的甲基化修饰并不干扰P300结合;  然而甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,  P300与启动子的结合则受到抑制。结论MeCP2与甲基化修饰的IL-6启动子相结合, 可阻遏转录因子与启动子结合, 从而进一步抑制启动子的转录活性。